Se fundamenta en la exclusión de sífilis y herpes, y en el aislamiento del agente causal en el cultivo. Se puede realizar tinción de Gram del exudado de la úlcera para visualizar H. Ducreyi aunque la reacción en cadena de la polimerasa es más sensible y específica para ello.
El microorganismo también puede demostrarse en muestras de tejido mediante coloración de Giemsa.